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Terapia Genica Cheat Sheet by

Gene Theraphy and vectors
terapia     genica     genetica

Vettori

Murini e Aviari
Si possono eliminare molti o tutti i geni. Studi con HSC su topi e sorting magnetico. Usati per le SCID, mettendo in HSC una copia del gene sano, e basta solo una copia in quanto è una malattia X-li­nked. (Gene ada o Gene della catena gamma).
Retr­ovi­rali
Hanno: 2 LTR (formate in retrot­ras­ciz­ione); 3 geni (Gag, che codifica per il tRNA e PBS, Pol, che contiene trascr­ittasi inversa proteasi e integrasi, Env proteine dell'e­nve­lope). Svan­tag­gio s'inte­grano solo in mitosi. Esistono anche con LTR non funzio­nante: sIN. Esempi: Virus di Molony e Virus di Rous. Inte­gra­zione casuale, ma spesso in siti di trascr­izione MECOM.
Lent­ivi­rali
Hanno: LTR; Gag; Pol; Env; geni accessori (Rev e RREV); Segnale d'inca­psi­dam­ento; tRNA; Trascr­ittasi Inversa; Proteina G del VSV; Promotore e gene terape­utico. 1° genera­zione a bassa sicurezza. 2° Genera­zione delezione geni non import­anti. 3° genera­zione LTR non funzio­nante, uso di promotore, 3 plasmidi di packaging. Integr­azione abbastanza casuale: Hots­pots.
AAV
ssDNA, 5Kbp. Polarità + o - incaps­ida­mento al 50% con una polarità o l'altra. Hanno: 2 ITR; Rep e Cap. Non sono patogeni; Alta moltep­licità d'infe­zione (Cocktail di geni); Integr­azione sul crom­osoma 19; uso anche su cellule perenni; pers­ist­enti, usati per fare topi transg­eni­ci; tropismo selett­ivo per cuore; muscolo e pancreas. Associati a metodi per la rottura del DNA (per evitare il legame con l'MNR complex)

Terapia Genica per l'Occhio

È un organo molto adatto alle applic­azioni di terapia genica. Perché:
è facil­mente access­ibile
presenta una struttura anatomica molto compar­tim­ent­ali­zzata che consente la sommin­ist­razione locale di vettori, ed è un sito immu­no-­pri­vil­egi­ato. Questo perché, anche nel caso in cui il soggetto presen­tasse Ab anti-AAV, nell’o­cchio i vettori non sarebbero non sarebbero eliminati.
esistono molti modelli animali facilmente reperibili (Cane mutato RPE65).
Il vettore AAV, sommin­istrato in via intr­a-v­itr­eale (nel bulbo ottico) è capace di trasdurre le cellule gangli­onari della retina che poi arrivano al cervello.
Invece è possibile inserire nello spazio sott­o-r­eti­nico la siringa per la sommin­ist­razione dei vettori AAV trasdu­cendo i fotore­cettori e cellule intermedie (epitelio pigmen­tato).
 
La terapia genica ha riscontro per:
Amaurosi congenita di Leber: è una retinite pigmen­tosa in cui coni e baston­celli degene­rano. Quando la luce colpisce la rodopsina, la reazione che stimola il nervo ottico è irrev­ers­ibile => dev'es­serci un turnover dei dischi che avviene per fagocitosi da parte delle cellule dell’e­pitelio pigmentato retinico. Poi saranno sostituiti da nuovi dischi che arrivano in superf­icie.
Mecc­anismo di fagocitosi inatti­vo: => fotor­ece­ttore degenera. La cosa inizia a livello dei baston­celli ( che sono più sensibili a causa dell’alto turnover dei dischi) restri­ngendo il campo visivo fino alla cecità. Dal punto di vista istologico vi è un assot­tig­liato dello strato dei recett­ori, con perdita dell’i­ntero recettore. Terapia nell'u­omo: AAV RPE65 iniezione sotto-­ret­inica. Si vedono miglio­ram­enti.
Reti­nos­chi­si: Difetto genetico per cui le 2 metà della retina non si fondono perfet­tamente e si hanno bolle a livello sotto-­ret­inico. Approccio classico di terapia genica: rilascio di una proteina mutata (RS1).
Coro­ido­idr­emia: Difetti nel gene REP1 (Rag Escort Protein 1). Si ha assott­igl­iamento della retina => degene­razione della retina, trattata con un vettore AAV-REP1.
Ceci­tà: per ristab­ilire la visione si stimolano dirett­amente le cellule gangli­onari della retina. Qui si usa l'op­tog­ene­tica che converte le cellule gangli­onari della retina in fotore­cettori trasfe­rendo i geni delle proteine sensibili alla luce.
Age Macular Degene­ration, AMD: La zona della macula e della fovea può degenerare per patologie diverse:
1) Forma secca: Atrofia dei recettori. Forma meno grave e più frequente.
2) Forma umida­:D­ovuta a neo-va­sco­lar­izz­azione retinica, data da iperpr­odu­zione di VEGF, in cui i vasi sanguigni invadono la macula => non funzionano bene in quanto iper-p­erm­eabili e causano edema, emorragie e cecità. Forma più rara e più grave, anche in progre­ssione. Terapie:
Apta­meri: Macugen lega il VEGF a 165 ammino­acidi e lo blocca, con iniezione intra-­vit­reale.
MAb anti-V­EGF­:­Luc­entis, legante tutte le forme di VEGF, con iniezione intra-­vit­reale.
Avas­tin: sviluppato per tumori al colon, costa meno del Lucentis e ha lo stesso effetto.
Cellule staminali embrio­nali: molto dibattute perchè portano a teratomi.
Anatomia occhio: dal bulbo, verso la parte più interna dell’o­cchio, troviamo prima il nervo ottico, poi al disotto i fotore­cet­tori, e al disopra un epitelio pigmen­tato.
Foto­rec­ett­ori, lo strato esterno è formato dai dischi in cui sono inserite le proteine utili per la visione:
I baston­celli contengono solo la rodopsina.
I coni possiedono 3 pigmenti respon­sabili della visione dei colori (eccitati dalla luce a diverse λ).

Terapia Genica del Cuore

Le CVDs compre­ndono una serie di patologie comprendo:
ICTUS,
ISCHEMIE DEGLI ARTI INFERI­ORI: claudi­catio, insuff­icienza trofica da irrora­zione => comparsa di ferite che non guaris­cono, gangrena franca.
MALATTIE ISCHEM­ICHE, come la card­iom­iopatia ischem­ica: occlusione di un vaso. Le placche che si formano non necess­ari­amente occludono il vaso ma limitano il flusso di sangue in modo costante. Per riaprire il vaso si usa un palloncino che si rigonfia. Ma c'è compli­canza da REST­ENO­SI: processo a livello della tunica media in cui si ha un aumento della prolif­era­zione che porta alla richiusura del vaso. Si risolve con stent medicati insieme a rapam­icina che bloccano la prolif­era­zione, associati ad antico­agu­lanti.

ANGI­OGE­NESI formazione di vasi sanguigni in tessuti adulti, avviene in venule post capillari: Spro­uti­ng. Come avviene?
Il VEGF (o FGF) induce la degrad­azione della membrana basale del vaso preesi­stente e le cellule migrano formando un tubo primitivo che va verso la sede di produzione del VEGF (conce­ntr­azione più alta). Questo vaso primitivo è formato da 2 tipi di cellule endote­liali:
1. tip cells sul fronte d’inva­sione del vaso, non prolif­erano, sentono il gradiente chemio­tattico e tramite noch signaling inducono il differ­enz­iamento delle cellule vicine in stock cells.
2. stock cells altamente prolif­era­tive.
Quindi il neo-vaso subirà rimode­lla­menti: smette di prolif­erare quando incontra altre cellule che lo rendono indipe­ndente da VEGF e regolano la direzi­onalità di crescita.
Poi matura grazie a: angi­opo­ietine, PDGF-B, TGF-β.
Delivery di VEGF a livello del cuore per via:
intrav­enosa
intrac­oro­narica
Dirett­amente nel cuore dall’e­ndo­cardio o dall’e­sterno
Intrap­eri­cardico per trattare cardio­patia ischemica.
Periva­scolare (rilascio di VEGF attorno ai vasi).
Iniezione nel al seno corona­rico.
Negli arti inferiori:
Iniezioni multiple intram­usc­olari degli arti inferiori
Intrar­terioso

Terapia Genica Obbiet­tivi:
1. Indurre neo-an­gio­genesi delle aree del miocardio normal­mente non ri-vas­col­ari­zzabili con le metodiche classiche.
2. Cardio protec­tion, dei cardio­miociti vivi.
3. Rigenesi del miocar­dio.

Terapia per la Neo Angiog­enesi
Uso di biofar­maci: smallRNA o miRNA; proteine ricomb­ina­nti => sicure ma non efficaci in pazienti con CHD (Chronic heart Disease) e PAOD (Ischemia perife­rica). Perchè?
⚠ Per formare un vaso stabile servono almeno 14/30 giorni in cui è attiva­mente presente VEGF => emivita in vivo insuff­ici­ente. Non si hanno problemi di mutagenesi inserz­ionale, tipica dei vettori retrov­irali.
VEGF come plasmide nudo o con Adenov­irus iniziale risposta positiva => Fase 2 non funziona!. In adenovirus => risposta infiam­matoria elimina le cellule trasdo­tte!
Vettori AAV: Si usa VEFG sotto controllo di promotore tet on/off e doxi­cic­lina in vivo per 30 giorni: VEFG è espresso, i vasi si formano e restano anche se poi spegniamo il gene.
VEGF = Vascular Endotelial Growth Factor famiglia di proteine. più isoforme, ognuna lega un recett­ore;il princi­pale: VEGF­R-2­/KD­R/F­Ik-1
FGF = Fibroblast Growth Factor
BYPA­SS: Con vena del paziente si fa l'anas­tom­izz­azione a monte e a valle della zona occlusa. No in pazienti con malattie multi-­vasali quindi nel tempo hanno scompenso cardiaco.
Sistema NOGA: mappatura elettr­o-m­ecc­anica del cuore e rilascio di fattori terape­utici nel miocardio.
 

Terapia Genica del Muscolo

Dist­rofia muscol­are: altera­zione delle proteine del complesso DGC che coinvolge la distr­ofina proteina con peso di 427kDa; 2,4 Mbp di cui la coding region 11kbp.
Due forme cliniche: DMD e DMB.
DMD: proteina tronca o instabile quindi non funzio­nante. terapia: Cortic­ost­eroidi per alleviare i sintomi.
BMD: delezione dei siti centrali della distrofina senza compro­mettere i domini N-t (che lega l'actina) e C-t ( Che lega il complesso DGC). Qui la distrofina è più piccola ma funzio­nante: patologia meno grave della DMD.
Terapia Genica: Trasforma la DMD in DMB. però il gene della distrofina è molto grande e ci sono problemi a inserirlo intera­mente.
Vettore di scelta: AAV, anche se piccolo => produ­zione di una distrofina più piccola: Mini- distrofine (6kbp) e Micro-­dis­trofine (4kbp) con entrambe N-t e C-t.
Altre terapie:
exon skippi­ng: oligontd antisenso, ristab­ilisce il frame di lettura, esclude uno o più esoni dalla traduz­ione. Risultato: distrofina più corta, ma funzio­nale.
Geno­me-­edi­tin­g­:CR­ISP­R/Cas9.
Muscle building strategy 1 => NON FUNZIO­NA! L’utr­ofina= proteina omologa della distrofina (funzi­onale e strutt­urale) . Si fa con AAV.
Muscle building strategy 2: sull’asse fallis­tat­ina­-mi­ost­atina. La 1° inibisce la 2°.

Differenza tra...

Animali Knock-­out
Animale in cui è soppre­ssa­,­l'e­spr­essione di un determ­inato gene.
Animali Knock-in
Animale in cui si sostit­uisce una sequenza endogena con un’altra sequenza e ci permette per esempio di studiare l’effetto della mutazione.
Animali Transg­enici
È inserito un gene in un animale e si aumenta la sua espres­sio­ne. I geni inseriti possono essere anche di un altro animale, e s’int­egrano casual­mente.

Terapia Genica del SNC

Vettore di scelta: AAV.
Obbi­ett­ivi: contro­llare i sintomi; promuovere la rigene­razione e soprav­vivenza dei neuroni; o rimpia­zzare la funzione del gene mancante.
Fattori Neurot­rof­ici:
Nuro­tro­fine: NGF (Nerve Growth Factor), BDGF (Brain Derived Growth Factor), Neuro­Trofine 3 e 4. Legano recettori Tyr-ki­nasici o TRK sulla membrana dei neuroni. Questi si associano in eterod­ime­riz­zazione con un altro recettore della stessa famiglia: p75. Ognuno dei Trk può legare uno dei membri delle neurot­rofine, mentre tutti sono in grado di legare il recettore p75.
Famiglia di GDNF (Glial Drived Neurot­rophin Factor): GDNF, neurot­urina (NTN), artemina (ART), persefina (PSP).
Famiglia del CNTF/LIF (Celialy Derived Neurot­ophic Factors e Leukemia Inibitory factor).
 
Alzh­eim­er: Atrofia cerebrale diffusa a causa della perdita di neuroni coline­rgici prima nell’i­ppo­campo e poi della corteccia cerebrale. Tera­pie:
1) sommi­nis­tra­zione di NGF per il modello di tratta­mento in animali => Effetti benefici:
- Protezione dei neuroni coline­rgici dopo una axotomia;
- Reversione dell’a­trofia legata all’in­vec­chi­amento;
- Migliora memoria e appren­dim­ento.
2) Trial clinici con NGF come proteina ricomb­inate (rNGF): sommin­istrata per via centrale.
3) Delivery Genico: Vettori virali (retro­virus di Moloney) ex vivo => prelievo fibrob­lasti autologhi, trasdotti con retrovirus che esprime NGF, e reimpianto nel cervello del paziente. Risultato: aumento del metabo­lismo cellulare del glucosio e formazione di neuroni coline­rgici => Minore declino cognitivo.
4) Studio in fase 1 con il CERE-110: Risultati => non funzio­na! C'è un bias sulle metodiche di sperim­ent­azi­one.
NB i neuroni non perenn­emente stimolati muoiono tramite apoptosi. Si può contra­stare con l'uso di fattori di crescita che promuovono la soprav­viv­enza: Fattori Neurot­rof­ici.

Terapia Genica: Morbo di Parkinson

Dovuto alla predita di neuroni dopami­nergici della sostanza Nigra.
4 possib­ilità di terapia genica:
AAV: trasdurre geni che aumentino la dopammina: attività dopami­nergica aumentata, sui sintomi non ci sono miglio­ram­enti;
Interf­erire con l’aggr­ega­zione proteica;
Produzione e delivery di fattori neurot­rof­ici;
AAV-­GAD: introd­ucono geni che producono GABA per regolare l'attività dei nuclei sotto-­tal­amici. L'enzima GAD produce i GABA.
Fase1: iniezione unilat­erale di AAV-GAD. Risu­ltati => riduzione di assunzione di Levodopa e miglio­ramento bilate­rale!
Fase 2 : Iniezione bilate­rale, valuta­zione sicurezza e metabo­lismo dei neuroni.
Terapie attuali:
1) Sommin­ist­razione della Levodopa (farmaco analogo del precursore della dopamina, che agisce sullo striato) associata alla Carbi­dopa (inibitore delle carbos­silasi perife­riche, che altrimenti inatti­ver­ebbero il farmaco). => perde efficacia nel tempo = Più effetti collat­era­li!
2) Deep Brain Stimul­ation Si danno scariche elettriche per tenere sotto controllo l’iper­ecc­ita­bilità dei neuroni sotto-­tal­amci. => Tratta­mento autoge­stibile in pazienti giovani.

Terapia Genica del cuore 2

TET-ON e TET-OFF:
TET-­off: ci sono due vettori:
1. Ha tTA (trans­att­iva­tore) fuso a VP16 (espre­ssione costit­utiva);
2. Ha il gene terape­utico legato ad un promotore artifi­ciale che è formato in parte è CMV e per il resto lega l'oper­atore tTETO.
Nel sistema quando non c’è tetrac­icl­ina tTA libero si lega a tetO e lo esprime; in presenza di tetrac­icl­ina lega tTA impede­ndogli di legare l’oper­atore => l’es­pre­ssione non avviene;
TET-­on: ci sono di nuovo i due vettori con le stesse caratt­eri­stiche ma con un controllo inverso => se c’è tetrac­iclina si lega a tTA e solo così tTA è capace di legarsi all’op­era­tore e quindi il gene si esprime.

Terapie per lo scompenso cardiaco
Obbie­ttivo: neo-ri­vas­col­ari­zza­zione di un arto o cuore ischemico.
Speri­men­tazione animale: Modello di cane instru­mentato con un occlusore idraulico nelle corona­rie.Nella regione irrorata da quella coronaria così come in una regione più remota sono posizi­onanti dei cris­talli piezoe­let­tri­ci. Il loro movimento è monito­rabile => registra parametri fisiol­ogici. Si induce un piccolo infarto al cui bordo è state iniettato AAV di controllo o esprimenti con VEGF. Si monitora la contra­ttilità del cuore e, in presenza di una zona infart­uata, si ha l’allo­nta­namento dei 2 cristalli in sistole => shortening negativo. In animali trattati con VEGF => ripresa della contra­ttilità fino all’80%. => Effetto diretto sui miocar­dio­citi.
Studiando i recettori di VEFG, in modelli animali, si è visto che iniettando AAV con il recettore VEGFb si è in grado di ripr­ist­inare e prevenire lo scompenso cardia­co.

Difetti della Serca2­a­=> aumento di calcio porta a contra­zione meno efficace, soluzioni possibili:
Inibizione del fosfol­ambdano => inibisce l’ATPasi SERCA2a
Indurre una maggiore espres­sione della pompa SERCA2a: con AAV1 => non funziona!
Modula­zione dell’a­ttività β-adre­nergica (più adrenalina più rilascio di calcio)
Esprimere proteine che possano avere un effetto cardio­-pr­ote­ttivo (VEGF e IGF1).

Terapia genica per la rigene­razione del cuore
I miocar­diociti hanno un minimo potenziale rigene­rativo che potrebbe essere riatti­vato, dopo il suo spegni­mento nella 1° settimana di vita. (Studi con C14)
I miRNA sono down (o up) regolati in seguito a scompenso cardiaco, e regolano la capacità prolif­erativa dei miocar­diociti durante lo sviluppo. Esistono marker di prolif­era­zione cellulare: miR199a e miR590 eviden­ziati con EDu e l’α-­act­inina in topo. Aurora B è un marker di citoch­inesi. In vettori che usano miRNa ai bordi di zone infartuate => si preserva funzione e la struttura, quindi rigene­raz­ione.
Target dei miRNA: silenziano simult­ane­amente geni per proteine di assemb­laggio della struttura sarcom­erica e citosc­hel­etr­ica.
Disa­sse­mblare il sarcom­ero => segnale che elimina l’hippo pathway.
Espe­rimenti su maiale: Quelli che hanno ricevuto AAV che esprime il miRNA dopo l'infarto hanno un cuore relati­vamente normale (lievi aree ipocin­etiche) ma dopo due settimane presentano aritmia o cluster di cellule prolif­era­nti causa => espres­sione di miRNA per lungo tempo => de differ­enz­iamento delle cellule cardia­che che hanno sviluppato delle strutture simili a tumori.
Quindi si pensa ora di sommin­istrare i miRNA come minis, cioè piccole molecole più sicure: in piccoli animali funzionano (restano per 12 giorni).
Recettori:
VEGF­-R2= principale recettore angiog­enico locali­zzato in corris­pon­denza dei vasi.
VEGF­-R1= locali­zza­zione miocar­dio­cit­ari­a,entro la struttura del disco interc­alare.
Fattori: (entrambi hanno effetto cardio­-pr­ote­ttivo)
VEGFa lega sia VEGF-R1 ché il VEGF-R2
VEGFb lega solo il recettore 1.
 

Terapia Genica dell'E­mofilia

Patologia X-Li­ked dovute alla mancanza o al malfun­zio­namento di alcune delle proteine della coagul­azione. Due forme:
Emofilia A: dovuta a un difetto del gene che codifica per il Fattore VIII.
Emofilia B: dovuta a un difetto del Fattore IX.
Terapia sosti­tut­iva: trasfu­sione di sangue.
Terapia genica: Basta una correzione del 10-50% per ristab­ilire il fenotipo normale. Vettore di scelta: AAV: il fattore 8° è troppo grande per essere inserito, ma per il 9° va bene. Se iniettato nel muscolo il fattore 9° porta ad aumento di sintesi di fattore 9° a livello locale; ma non avviene ciò nel fegato a causa di ab-anti AAV che causavano infiam­mazione epatica.
 
In pazienti con emofilia B severa trattati con AAV8, nel fegato, e usando vettori scAAV(self comple­mentary AAV), ed un fattore IX-codon optimized cioè con più proteina e più stabile rispetto alla wt, si è riscon­trato nel tempo un’esp­res­sione tra il 2 ed il 11%. Nel 2014 i 6 soggetti sono liberi dalla terapia sostit­utiva.
 
Si sono fatti anche studi per l’emofilia A e si è sviluppato un sistema dove si elimina il dominio B del Fattore 8 che si può produrre e clonare nell’AAV 5 (che accomoda geni più grandi).
Si sono scoperti pazienti che hanno un fattore 9 mutato è più funzio­nante del normale. Sono in corso sviluppi anche di un fattore IX-Padua, con sostit­uzione di 2 nt e un AA, determ­inando un fattore 9x più attivo di un fattore IX normale.

Terapia genica SMA e SLA

1) Atrofia Muscolare Spinale (SMA): Malattia genetica data dal gene SMN (Survival Motor Neuron) presente in due tipi di copie: SMN1 (telomero) e SMN2 (centr­omero).
SMN1 codifica per la proteina SMN, essenziale per la soprav­vivenza e il normale funzio­namento dei motone­uroni.
I pazienti affetti da SMA hanno un numero variabile di copie di un secondo gene, SMN2, codifica per una forma accorciata della proteina SMN, con funzio­nalità ridotta al 10%. Il n° di copie del gene SMN2 è alla base della grande variab­ilità della patologia. Tipologie:
- Tipo 1: solo 2 copie di SMN sano: 15% di SMN funzio­nante, è la forma più grave.
- Tipo 2: Hanno maggiori quantità di SMN e quindi presentano varianti meno severe della condiz­ione.
- Tipo 3 e 4: In età adulta, hanno più proteina, è la forma meno grave.
Terapie con vettori virali:
AAV9 buoni risultati, ma aumento degli enzimi epatici dato da AAV, che può essere contro­llato;
Olig­onu­cle­otide anti-s­enso: Nusin­ersen interf­erisce con lo splicing della proteina SMN2 => aumenta la proteina funzionale con buoni risultati in tutte le forme.
NB: entrambe sono terapie che alleviano i sintomi ma non guaris­cono.
 
2) Sclerosi laterale amiotr­ofica (SLA): Malattia sporadica che determina degene­razione dei motone­uroni sia superiori, che inferiori. Il decorso di questa patologia può essere rallentato dal tratta­mento con farmaci glutam­mat­o-b­loc­canti (riluzolo) ma funziona poco o nulla. Il 10% delle forme sono genetiche domina­nti e il gene mutato è l’enzima supero­ssido dismutasi 1 (SOD­1). Questo ha 3 isoforme: SOD1 citopl­asm­atica;2 mitoco­ndr­iale;3 esterna alla cellula. In topi knock-in si osserva una gain-o­f-f­unction del gene e sintom­ato­logia SLA-like. Terapie:
In topi VGF𝛿 𝛿 si hanno sintomi SLA-like, ed esprimono meno VGF a livello spinale. Ottenuti con delezione in una regione sensibile all’ip­ossia di VEGF. => No difetti vascol­ari! La sommin­ist­razione di AAV-VEGF prolunga la vita del topo sia per un’ini­ezione intram­usc­olare ché per via intra-­cer­ebr­o-v­ent­ric­olare. In genere ogni neurone termina con una giunzione neurom­usc­olare, ma il VEGF dà origine a multiple giunzioni neurom­usc­ola­ri. Con il VEGF pare che queste si stabil­izzano a seguito di iper-s­pro­uting assonale.
VEGF è nato come fattore neurot­rofico ma nell'e­vol­uzione è stato adottato per lo sviluppo dei vasi sanguigni. VEGF è il fattore pleiot­ropico per eccell­enza.
Il cono di crescita del neurone sviluppa dei filo­podi e lame­lli­podi: estrusioni ricche di recettori per fattori di crescita che stimolano la crescita e ne guidano la direzione di crescita. Queste sono molto simili a quelle delle tip cells endote­lia­li.

Terapia genica dei Tumori

Onco­gene: è un gene che porta la cellula verso lo sviluppo di un fenotipo neopla­stico
Onco­sop­pre­sso­re: è un gene che codifica per prodotti che agiscono negati­vamente sulla progre­ssione del ciclo cellulare, proteg­gendo la cellula dall'a­ccumulo di mutazioni potenz­ial­mente tumorali.
Cancer gene atlas: ha mappato circa 200 geni coinvolti nella trasfo­rma­zione neopla­stica.
Si può agire su:
Sulla cellula tumorale modifi­candole dirett­amente, compresi i meccanismi che la trasfo­rmando cellula tumorale. Tramite:
a) inibi­zione della prolif­era­zione,
b) trasf­erendo geni suicidi in queste,
c) sfruttando virus oncoli­tici.
Le prospe­ttive non sono troppo incora­ggi­anti.
Sul SI Attiva­ndolo contro il tumore, e contra­stare la crescita delle cellule cancerose (imm­uno­-ge­ne-­the­rap­y). Si fa con:
a) aumento della stim­ola­zione antige­nica da parte del cancro,
b) aumentare la risposta delle cellule T citoto­ssi­che
c) Modificare le cellule T citoto­ssiche effe­ttrici attive contro le cellule tumorali.
Attivando il SI si può aspirare in un’i­mmu­not­erapia dei tumori.
Sulle cellule staminali ematop­oie­tiche trasfe­rendo in queste i geni che riducono la tossicità della chemio­ter­apia. Per aumentare l’indice terape­utico della chemio­ter­apia.

Primi tentativi : attiva­zione di oncoso­ppr­essori o inatti­vazione gli oncogeni. => Prima con oligontd naive dove si blocca la sintesi di un gene alterato, che altrimenti attive­rebbe il ciclo cellulare.
=> Poi si sono usati oligontd fosfot­ioati modificati con sostit­uzione di un ossigeno con uno zolfo per impedirne la degrad­azione.
=> Poi con LNA (morfolino => knockout in zebrafish) o PNA
Risultatom => 0! Sevono molti oligontd per bloccare gli mRNA di un gene alterato.

Ribo­zimi: struttura a RNA, attività enzima­tica, si associano a mRNA lo tagliano e lo distru­ggono. Due tipi:
1. Hamm­erhead : Si possono associare a qualsiasi sequenza per la quale siano proget­tati.
2. A forcina: Funzionano in modo analogo agli Hammerhead (struttura 3D poco più comple­ssa).
=> Si sono sviluppati per la Leucemia Mieloide Cronica ma sono stati rimpia­zzati dal Gleevec che inibisce la chinasi ibrida Bcr-Abl.

iRNA: sistema endogeno di silenz­iamento degli RNA.

Pro drug therapy: con prof­arm­aci sfrutta il meccanismo dell’H­erpes simplex. I farmaci si attivano con la timidina kinasi, presente nelle cellule infette, tramite fosfor­ila­zione. => è incorp­orato nella catena nascente del DNA e porta la cellula alla morte. => non fa niente alle cellule sane, ma uccide selett­iva­mente quelle infettate dal virus.(p­rof­armaco: Ganc­icl­ovi­r­=> funziona in topo ma non in uomo => effetto by-sta­nder: respon­sabile della replic­azione tumorale in animali, le cellule infettate che muoiono rilasciano metaboliti tossici che entrano nelle cellule vicine. => effetto positivo in topo, ma non è presente nell'uomo!

Virus Oncoli­tici Si è visto che in soggetti con tumore in un certo stadio, se contra­evano patologie virali e poi guarivano, erano anche guariti dal tumore! => Si può usare dirett­amente il virus per uccidere il tumore! Funzionano bene associati a chemio­ter­apia.
Uso di Aden­ovi­rus: esprime E1A (ma non E1B). Nei tumori p53 non è attivo => ciclo replic­ativo del virus = morte cellule tumorali, il virus si diffonde ad altre ( nelle sane invece p53 è attivo e si induce apoptosi)
ONYX­015: iniettato in modo intrat­umorale e privo di E1B => effetto cito­patico selettivo per le cellule p53 negati­ve.

Immu­not­erapia dei Tumori: poco efficace
Target: cellule tumorali; rafforza il SI
Sfrutta: Tal (che fanno homing nel tumore) => per tumori metast­atici
Meccan­ismo: aumento prolif­era­zione dei linfoc­iti, esposi­zione ad antigeni di superficie tumorali specif­ici.
Tipologia: Attiva stimol­azione diretta del SI => DNA Vaccin­ati­on: sia risposte umorali, sia citoto­ssi­che. Usa Gene Gun
Vettore di scelta: Aden­ovi­rus genoma abbastanza grande in cui può essere facilmente introdotto il gene terape­utico. Quelli di 1° e 2° gen sono usati per far esprimere gli antigeni tumorali o stimolare risposta del SI con cito­chi­nine (stimolano la prolif­era­zione dei linfociti)

Igne­gne­rizzare Linfociti T citoto­ssici
I linfociti t hanno un antigene per TCR, funziona in associ­azione al CD3 => attiva la chinasi ZAP70 => segnale di attiva­zione della risposta linfoc­itaria.
Si crea la molecola artifi­ciale Car che permette a tutti i linfociti di targettare i tumori. Struttura della Car:
1) esterno ha il dominio di ricono­sci­mento dell'a­ntigene tumorale
2) interno il sistema di segnal­azione ZAP70
Vettore: Virus lent­ivi­ral­i/r­etr­ovirus che esprimono Car per Linfociti T citoto­ssici.
Risultato: Buono se il tumore esprime molti antigeni specifici!
Eter­oge­neità tumora­le: non tutte le cellule tumorali sono uguali.
Cancer stem cells: hanno un alto potenziale prolif­era­tivo.
locked nulcleic acids = LNA
PNA = peptide nucleic acid
Proteine Adenov­irus:
E1A: effetto pro-pr­oli­fer­ativo => attiva p53
E1B: blocca p53 => il virus fa ciclo litico
TAL = Tumour Associate Lympho­cyte fanno homing nel tumore
TCR = T Cell Receptor
Car = chimeric antigen receptor

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